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提示：

細胞生物學：小鼠胚胎干細胞培養實驗步驟

以下是根據NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干細胞培養protocol整理而成。根據經驗作部分修改。

　　1、一般培養-保持胚胎干細胞處于未分化狀態

　　培養基

　　細胞復蘇

　　凍存細胞

　　明膠包被

　　細胞傳代

　　2 、體外分化

　　培養基

　　包被有多聚鳥氨酸/纖維結合蛋白的培養板（使用或不使用蓋玻片）

　　體外分化方法

　　注：以下培養針對于小鼠的R1胚胎干細胞系，其它胚胎干細胞的培養可以參考。不過人的胚胎干細胞培養不可以采用下面的protocol，需要用專用的protocol和培養基。

　　一般培養——維持ES細胞處于未分化狀態

　　ES細胞培養用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed細胞的培養基（高糖）來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經過包被的組織培養板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養。如果在Feed細胞，那么就需要采用MMC進行處理，抑制Feed細胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。

　　培養基

　　ES：

　　配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養基——見下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基，0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃，時間不要超過2周。

　　貯存液

　　DMEM（高糖）

　　馬血清（HS）

　　L-谷氨酰胺（200mM）

　　MEM NEAA（10mM）

　　HEPES（1M）

　　β-巰基乙醇（55Mm）

　　PEST

　　LIF

　　復蘇細胞

　　細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結晶的形成，結晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。

　　步驟：

　　1.從液氮中取出一管細胞；

　　2.將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好完全溶解）；

　　3.將細胞轉移到一15ml Falcon管中；

　　4.加入5ml ES培養基（用培養基沖洗凍存管）；

　　5.離心3分鐘；

　　6.棄上清，用2ml ES培養基重懸細胞，至少吹打10次；

　　7.接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養皿；

　　8.孵育。

為什么很多實驗用小鼠胚胎干細胞

提示：

為什么很多實驗用小鼠胚胎干細胞

做實驗之所以常用小白鼠，主要有以下幾個原因：
第一：老鼠中的小白鼠的基因序列和人類的差不多，它的全基因組和人類的相似度極高，很多人類難以治愈的疾病可以在小白鼠身上找到相似性狀，從而加以實驗發現治病基因。

第二：實驗專用白鼠的生物學意義較大，培育出的小鼠幾乎完全沒有個體差異(生理上)。生理上沒有個體差異是否意味著氣質上沒有差異尚不明了，不過選擇純系實驗白鼠主要還是為了盡可能的減少先天的個體差異。

第三：數量充足，許多實驗需要統計學分析，這就要求一定的數量，大白鼠和小白鼠，特別是小白鼠，在人工繁殖條件下，能滿足這一要求。還有動物等級，小白鼠好歹也是哺乳動物，除了體形小，與其它哺乳動物的進化水平相比并不差。體形小反而成為人工繁殖喂養的有利條件。

第四：其實很多實驗用猩猩等與人更近似的動物做最好，但使用猩猩太昂貴了。許多實驗，比如認知類的，實驗結束后時需要將動物殺死，來檢查其內部變化的。這樣，大量的實驗肯定就不能用比較“貴重”的猩猩了。

第五：由于這種大型的哺乳動物受到動物保護協會的保護。那么多不“人道”的實驗也就受到限制了。即使用的是小白鼠，動協的人仍然有抗議呢。

第六：一些實驗用不著那些大型的，復雜的動物來做。